怎么留斜刘海？怎么留斜刘海

2019年底爆发的SARS-CoV-2至今仍在全球范围内传播，成为了研究界、科学界和世界的焦点。目前的医疗资源主要集中在

确诊患者的治疗和疑似病例的筛查

工作上。而随着新冠病毒的不断变异，各种变异毒株层出不穷，并且对目前的新冠疫苗有效性都有降低作用。其中，一种被称为

”德尔塔“病毒

的新冠变异株已经广泛在全世界流行起来，它的特点是

潜伏期短、传播速度快、病毒载量高

，这对于疫情防控难度极大。

德尔塔变异株最早于2020年10月在印度发现，相较于野生型毒株，德尔塔变异毒株会更容易在人群中形成聚集性感染，并且降低现有疫苗、抗体等药物的有效性，形成免疫逃逸，从而蔓延至世界各地引发新一轮疫情。美媒日前披露该国疾病控制与预防中心(CDC)的报告指出，德尔塔新冠变种病毒的传染性和水痘一样高，对于突破新冠疫苗保护的能力更强，因此已接种疫苗的人仍可能感染，并传染给其他人。

随着南京新一轮疫情的爆发，研究发现，此次引发南京疫情的毒株正是目前广泛流行的”德尔塔“变异毒株。为了能够

快速分离检测到变异病毒

，南京政府也开始在各高校征集可靠的仪器进行检测。那么，对于来势汹汹的“德尔塔”变异株，科学界是如何快速分离并检测出病毒的呢？

病毒分离与纯化

在新型冠状病毒爆发初期，科学界普遍缺乏对新冠病毒的认识。COVID-19在全球的大流行，促进了利用PCR技术和测序技术检测SARS-CoV-2的应用。但是，SARS-CoV-2 研究越来越需要了解病毒如何发挥作用、如何影响身体和免疫系统、病毒如何随时间进化，以及如何开发新的疫苗和治疗方法。因此，

分离病毒毒株

可为研究该病毒的生物学性状、致病机理、流行规律等提供有力的病原学数据。

当前病毒毒株的主要获取手段为，

首先将患者的肺泡灌洗液或者咽拭子标本经稀释、离心后取上清液、并接种在VeroE6细胞上。然后通过吸附培养、添加营养液、孵育离心后得到病毒分离液

。分离到的病毒株又可进一步通过测序等试验分析该病毒是否发生变异，为后续抗击疫情工作提供重要信息。

在COVID-19疫情爆发的早期，许多机构均在第一时间分离纯化得到早期新冠病毒毒株。例如：疫情爆发初期，武汉病毒研究所将患者的支气管肺泡灌洗液样本接种于VeroE6和Huh7细胞中，成功分离出了SARS-CoV-2病毒。

福建省疾控中心将早期COVID-19病例的咽拭子样本接种于VeroE6细胞，放在36℃培养箱培养，成功从福建省早期COVID-19病例中分离得到SARS-CoV-2病毒。

广州海关技术中心取患者的咽拭子样本接种于Vero E6，培养3天后细胞也出现明显病变。通过qRT-PCR、全基因组测序和间接免疫荧光等方法验证，继而分离到第1株广州本地感染病例的SARS-CoV-2毒株。

以上事例说明，在疫情早期时候，除了严格防控疫情扩散外，

分离纯化出完整的病毒毒株也是各项工作中的重中之重

。

作为一款可分离活和灭活 SARS-CoV-2 完整病毒和 VLP的产品，

Dynabeads 磁珠完整病毒富集试剂盒（针对 SARS-CoV-2 优化）

可用于从稀释细胞培养物和病毒运输培养基中富集完整、存活的SARS-CoV-2冠状病毒。富集温和快速，可在短至20分钟内完成。

该方法分离得到的完整病毒可用于功能研究

。富集的完整病毒可用于进一步的病毒生长或任何下游功能分析、蛋白研究、用于PCR的RNA纯化等。

病毒的分子检测技术

核酸检测方法包括

RT-PCR、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、环介导等温扩增技术(LAMP）

等。

其中，

实时定量PCR（qRT-PCR）作为SARS-CoV-2鉴定的金标准

，也是世界卫生组织（ＷＨＯ）推荐的常规确认试验。

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

在进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）时，研究人员通过将SARS-CoV-2与冠状病毒相关序列比对，确定特异性的SARS-CoV-2引物，然后用qRT-PCR技术来验证其引物的灵敏度。

该流程可成功检测出SARS-CoV-2病毒，并可成功区分SARS-CoV-2和其他冠状病毒如SARS-CoV等。

RenJ等[1]建立了针对SARS-CoV-2基因组中ORF1ab和核衣壳（N）基因的qRT-PCR检测方法。应用此方法，研究团队在流行病学调查中发现一名无症状女童。2020年2月24日入院时，她没有临床表现。咽拭子的qRT-PCR呈阴性，但尿液呈阳性。而在接受了抗病毒和对症支持治疗后，2月26日，咽拭子qRT-PCR呈现阳性。表明，无症状患者的尿液具有传染性。当咽拭子的qRT-PCR阴性时，尿液中的qRT-PCR可能是一个有用的筛查补充。

值得注意的是，在SARS-CoV-2病毒序列还未公开发布之前，就有团队运用qRT-PCR技术，设计了一套SARS-CoV-2的诊断流程，并投入了实际应用。另外，为了增加灵敏度和特异性，该技术还有不少改进版本，比如Taqman探针法、双重或多重荧光PCR等。

而作为一款在cDNA合成实验应用中使用范围最广、引用率最高的反转录酶，最新一代的

Invitrogen Superscript IV 反转录酶

，可提供出色的cDNA合成性能，即使是针对复杂RNA样本。从SuperScript II、SuperScript III到最新的SuperScript IV，一直引领着反转录领域的创新。在热稳定性、持续合成能力、cDNA产量、抑制剂耐受性等方面均具有出色的优势。

SuperScript IV有多种形式可供选择，包括单酶形式、完整的试剂盒形式、经优化用于qPCR的VILO预混液形式、一步法RT-PCR形式、用于细胞直接反转录的CellsDirect形式等。

其优势包括：

超高效（Super-efficient）

- 相比普通反转录酶，cDNA产量可高达100倍；

超灵敏（Super-sensitive）

- 在RT-qPCR反应中Ct值比使用普通反转录酶可降低多达8个循环；

超强劲（Super-robust）

- 即使对于降解RNA样本或含抑制剂的RNA样本，也能进行高效的cDNA合成；

超快速（Super-fast）

- 将反应时间从 >50 分钟缩短至 10 分钟。

环介导等温扩增技术（LAMP）

环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术。

能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。

其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。

Shirato K等[2]开发了一种新的RT-LAMP检测MERS冠状病毒的方法，使用针对保守核衣壳蛋白区域的引物序列，发现RT-LAMP法检测到的MERS-CoV RNA仅为3.4拷贝，特异性高，与其他呼吸道病毒无交叉反应。还进行了从含预滴定病毒的咽拭子接种培养基中检测MERS冠状病毒的初步实验，结果发现RT-LAMP检测灵敏度与MERS-CoV实时RT-PCR相似。对LAMP技术测定程序进行改进后，LAMP技术可以检测更微量的病毒RNA。

He, YG等[3]建立了一种单管比色RT-LAMP方法用于视觉检测SARS-CoV-2 RNA。该分析将基于Si-OH磁珠(MBs)的快速RNA提取和快速等温扩增集成在一个单管中，从而绕过RNA洗脱步骤，直接扩增磁珠吸附的RNA分子，得到可视化的结果。这种单管比色RT-LAMP检测方法可作为一种快速、灵敏的COVID-19诊断检测的替代平台，特别适合在社区诊所或乡镇医院使用。

实现上述这些高灵敏的检测方法，一款高效强劲的试剂则是必不可少的。

通常用于 LAMP 的酶是 Bsm DNA 聚合酶

，其为 Bacillus smithii DNA 聚合酶的一部分，相当于 Bst DNA 聚合酶大片段。 它具有很强的链置换活性，最适温度为 60°C。Bsm DNA 聚合酶的扩增非常有效，可在短短15 分钟内复制 10 亿倍的 DNA 靶标。该酶对复杂样品中的抑制剂有很强的抵抗能力，所以植物组织、血液、尿液或唾液只需简单处理即可进行检测。

Thermo Scientific Bsm DNA 聚合酶（长片段）等同于Bst DNA聚合酶，具有极强的链置换活性，可高效用于等温DNA扩增。

CRISPR/Cas技术

SHERLOCK技术

由张锋团队于2017年发明，此后在拉沙热、埃博拉、寨卡病毒、登革热等RNA病毒疫情检测中大显身手。2020年2月14日，美国麻省理工学院Broad研究所张锋教授等人开发了一种基于SHERLOCK的COVID-19诊断技术。该技术具有特异的高灵敏度，每微升里仅10-100个病毒拷贝，就可以被检测出来。

且步骤简单，只需三步，一小时内就可以完成检测。

此外，复旦大学的研究团队也开发出了一套名为“

opvCRISPR

”的新型冠状病毒检测系统，相较于主流的RT-PCR方法，该系统具有检测时间短、灵敏度高、结果可视化的特点。研究将逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）及Cas12a剪切酶整合到一个系统中，使该系统能够在45分钟内就能检测接近单个分子的样本，最终诊断结果也与实时定量RT-PCR测定结果一致。

高通量测序技术

测序技术具有高通量、短时间、高精确度等优点，

可以快速精准定位目标基因。广泛用于病原体鉴定和监测病毒进化，在疫情初期此技术是最先检出SARS-CoV-2并成为确诊疑似病例的方法之一。

RenL等[4]收集了武汉市金银潭医院5例重症肺炎患者的临床资料和支气管肺泡灌洗(BAL)标本。基于llumina测序平台，提取BAL的核酸并进行下一代测序。测序结果表明该病毒在系统进化上与蝙蝠SARS样冠状病毒(SL-ZC45, GenBank MG772933)最接近，核苷酸同源性为87.6%至87.7%，但属于一个单独的分支。此外，该病毒的受体结合区（RBD）的氨基酸序列与SARS冠状病毒相似，表明它们可能有相同的受体。

ChenL等[5]用下一代测序技术（metagenomics Next Generation Sequencing，mNGS）对两名COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液标本进行宏基因组学分析，确定此病毒是一个新的冠状病毒种，病毒基因组的全长29881nt，并且归类为β属的一个新种。

深耕酶学研究40年，

赛默飞推出Invitrogen Collibri NGS文库制备系列产品

，旨在助力快速高效的制备NGS测序文库，适用于Illumina高通量测序平台。系列产品覆盖全基因组测序、RNA测序、文库定量和文库扩增。

独有颜色提示

- Invitrogen Collibri NGS文库制备试剂盒中每种试剂含有一种示踪染料，通过颜色变化可清晰观察文库制备过程，避免高代价的实验失误。

快速建库流程

- Invitrogen Collibri NGS文库制备试剂盒整合多款高性能试剂，如SuperScript反转录酶、SuperFi高保真酶等，且建库流程经合理优化，可在短时间内完成NGS文库构建。

此外，另一款Applied Biosystems? VeritiPro? PCR仪在Veriti PCR仪的基础上进行全面升级，满足现代化的实验需求。

VeriFlex技术

- 6区独立温度控制，梯度优化更精准；

更快的变温速率

- 6℃/s；

更静音

- 实验环境更舒适；

支持云功能和远程控制

- 随时随地监控仪器。

随着科学界更深入地了解SARS-CoV-2病毒，

赛默飞提供了创新、先进的解决方案，包括从病毒的分离，到多种检测方法建立，为未来做好积极准备，实现快速应对

参考文献

Ren J,Li D,Wang C,Wu J,Wang Y,Sun Y,Zhang Q,Wang Y,Chang X. Positive RT PCR in urine from an asymptomatic patient with novel coronavirus 2019 infection:a case report[J]. Infect Dis,2020,52(8): 571 574

Shirato K,Yano T,Senba S,Akachi S,Kobayashi T, Nishinaka T,Notomi T,Matsuyama S. Detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus using reverse transcription loop mediated isothermal amplification (RT LAMP)[J]. Virol J, 2014, 11 (1):139.

Zhang Y,Odiwuor N,Xiong J,Sun L,Nyaruaba R O, Wei H,Tanner N A. Rapid Molecular Detection of SARS CoV 2 (COVID 19) Virus RNA Using Colorimetric LAMP[J]. ResearchGate,2020.

Ren L,Wang Y,Wang J, et,al. Identification of a novel coronavirus causing severe pneumonia in human[J]. Chinese Med J, 2020,133(9):1015 1024.

Chen L,Liu W,Liu Y, et,al. RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak[J]. Emerg Microbes Infect,2020,9(1):313 319.